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利用间充质干细胞体外高效制造新生软骨

美国凯斯西储大学(Case Western Reserve University)研究人员发现,自组装的间充质干细胞层与填充满生长因子的微小珠子浸透在一起,要比以前的组织工程方法形成更加厚和更加硬的软骨。该研究成果已经发表在《控制释放期刊》(Journal of Controlled Release)杂志上。该研究是朝开发出可移植的软骨替换又走近了一步,并给治疗由于骨关节炎(osteoarthritis)、运动损伤和事故而遭受破坏的膝、肩、耳和鼻带来希望。

生物医学工程和矫形外科系副教授Eben Alsberg,也是这篇论文的主要作者,他说,“我们认为利用病人自己的干细胞促进软骨形成的能力和使用这种无需移植前长时间培养的方法的潜力使得这种技术有吸引力”。

Alsberg和他的研究小组将转化生长因子β-1放入生物可降解的明胶微球(gelatin microsphere, 亦可翻译为明胶微珠)中,而且这些明胶微球分布在整个干细胞层上,而不是简单地将干细胞层浸没在生长因子中。Alsberg说,这种工艺表现出很多优势。

这些微球提供类似于支架的结构,在这些微小珠子(即微球)降解后在需要维持的细胞之间产生空间间隔。这些间隔导致更好的水分保持---确保软骨弹性的关键因素。

明胶珠子暴露在这些细胞释放的化学物中发生降解,而且是以一种可控的速率发生降解。当这些珠子降解时,生长因子释放出来并与干细胞层内部和外部的细胞接触,从而使得干细胞更加均匀地分化为新生软骨(neocartilage)。

微球降解的速率和由此造成的细胞分化速率能够通过微球交联的程度来进行修改。在微球内部,不同数目的生长因子交联到聚合物上。这些交联越多,就需要细胞分泌的酶花费更长时间进来并降解这些物质。

研究人员制造5种类型的干细胞层:分布有含生长因子的稀疏交联的微球、分布有含生长因子的高度交联的微球、分布不含生长因子的稀疏交联的微球、分布不含生长因子的高度交联的微球和没有微球的对照层。最后三种干细胞层在含有生长因子的浴缸中培养。

在有盖培养皿(petri dish)培养三周之后,所有含微球的干细胞层要比对照层变得更加厚和更加富有弹性,其中分布有稀疏交联的微球的干细胞层长出最厚并且最有弹性的新生软骨。

这些结果表明稀疏交联的微球,被细胞分泌的酶更快地降解,为整个干细胞层持续性地供应生长因子,从而改善干细胞分化为软骨细胞(chondrocyte)的均匀性、程度和速率。

培养出的这种组织非常类似于关节软骨(articular cartilage)---在膝盖中发现的坚硬软骨:圆状的细胞被大量含有粘多糖(glycosaminoglycan, 也译为葡萄糖胺聚糖)的基质所包围。这种多糖将水离子封锁在组织中,从而使得组织具有抗压性能。测试也显示这种干细胞层含有最高量的II型胶原蛋白(collagen)---关节软骨中主要的蛋白组分。

尽管这种干细胞层要比对照层显著性地坚硬不少,但是人们还不知晓自然软骨形成机制。Alsberg研究小组如今正在研究各种方法来优化这种工艺以便制造出能够抵抗日常生活磨损的足够坚硬的替代性软骨。

这种工艺的一个主要的优势在于它可能避免在实验室中长时间培养软骨时所遇到的困难和高昂开销成本,相反还能允许一块软骨片更快地移植到病人身上。

因为含微球的干细胞层足够坚硬在培养早期便可进行处理,所以研究人员相信干细胞层只需一周或两周就可能用于临床治疗。身体内机械环境可能会进一步加强软骨形成,增加这种组织的强度和弹性,从而使得该组织发育成熟。

Engineered cartilage via self-assembled hMSC sheets with incorporated biodegradable gelatin microspheres releasing transforming growth factor-β1

Loran D. Solorio, Eran L. Vieregge, Chirag D. Dhami, Phuong N. Dang, Eben Alsberg

Self-assembling cell sheets have shown great potential for use in cartilage tissue engineering applications, as they provide an advantageous environment for the chondrogenic induction of human mesenchymal stem cells (hMSCs). We have engineered a system of self-assembled, microsphere-incorporated hMSC sheets capable of forming cartilage in the presence of exogenous transforming growth factor β1 (TGF-β1) or with TGF-β1 released from incorporated microspheres. Gelatin microspheres with two different degrees of crosslinking were used to enable different cell-mediated microsphere degradation rates. Biochemical assays, histological and immunohistochemical analyses, and biomechanical testing were performed to determine biochemical composition, structure, and equilibrium modulus in unconfined compression after 3 weeks of culture. The inclusion of microspheres with or without loaded TGF-β1 significantly increased sheet thickness and compressive equilibrium modulus, and enabled more uniform matrix deposition by comparison to control sheets without microspheres. Sheets incorporated with fast-degrading microspheres containing TGF-β1 produced significantly more GAG and GAG per DNA than all other groups tested and stained more intensely for type II collagen. These findings demonstrate improved cartilage formation in microsphere-incorporated cell sheets, and describe a tailorable system for the chondrogenic induction of hMSCs without necessitating culture in growth factor-containing medium.